Các phương pháp chẩn đoán virus gây bệnh

Những kỹ thuật phát hiện virus giúp ích rất nhiều trong việc nhận diện mầm bệnh, mặc dù một số phương pháp chỉ được sử dụng trong nghiên cứu do chi phí cao và kết quả chậm.

Virus hay còn gọi là siêu vi, siêu vi trùng hay siêu vi khuẩn. Đây là tác nhân truyền nhiễm chỉ nhân lên được khi ở bên trong một tế bào sống của một sinh vật khác. Virus có thể xâm nhiễm vào nhiều dạng sinh vật, từ động vật, thực vật cho tới vi khuẩn và vi khuẩn cổ.

Hiện nay, các phương pháp chẩn đoán virus có thể phát hiện trên 500 virus có khả năng gây bệnh cho người. Ngày càng có nhiều loại virus mới được phát hiện, gây bệnh là những vấn đề y tế toàn cầu như virus HIV, viêm gan B... Các bệnh nhiễm trùng do virus có thể là cấp tính, mạn tính, tiềm tàng hoặc nhiễm trùng chậm và cũng có thể gây ung thư. Trong đó, các bệnh nhiễm virus cấp hay mạn tính có hậu quả là thường hay gặp nhất.

Virus sống sót trong tự nhiên cần tiếp tục gây nhiễm cho các cá thể dễ nhạy cảm. Trong một vật chủ bị nhiễm, virus có thể gây một nhiễm cấp hoặc có thể tạo một khoảng thời gian dài nhiễm dai dẳng.

Ở giai đoạn nhiễm cấp, virus thường bị tiêu diệt bởi đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Do vậy, một số virus gây nhiễm cấp như: Virus sởi, virus quai bị, sống sót bởi liên tục gây nhiễm cho quần thể người; ngược lại, một số loại virus khác như virus cúm, virus sốt vàng, virus dại... lưu hành trong tự nhiên trên một loài khác nữa. Nhưng vẫn còn có những virus khác, nó tự có những đặc điểm cấu trúc cho phép nó có thể sống sót lâu dài cho đến khi gặp vật chủ cảm nhiễm.

2.1 Phát hiện nhanh bằng kính hiển vi

Kính hiển vi là một thiết bị dùng để quan sát các vật thể có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không thể quan sát được bằng cách tạo ra các hình ảnh phóng đại của vật thể đó. Kính hiển vi có thể gấp độ phóng đại bình thường lên từ 40 - 3000 lần.

2.2. Phát hiện nhanh bằng kính hiển vi điện tử

Đây là một trong các phương pháp chẩn đoán virus. Phương pháp hợp lý để phát hiện virus từ bệnh phẩm lâm sàng được ứng dụng để phát hiện virus từ mẫu bệnh phẩm dịch bọng mủ (đậu), mẫu phân (rota)... Tuy nhiên, nếu hiệu giá virus trong mẫu kiểm tra thấp sẽ không phát hiện được bằng kính hiển vi.

2.3. Phát hiện kháng nguyên

Đối với những virus không có nhiều typ huyết thanh, việc phát hiện trực tiếp kháng nguyên là phương pháp chẩn đoán nhanh trong phòng thí nghiệm, tuy nhiên kháng nguyên có trong mẫu phải có lượng đủ để phát hiện bằng huyết thanh chuẩn.

2.4. Phương pháp nhuộm miễn dịch (immunofluorescence và immunoperoxydase staining)

Phương pháp này được sử dụng phát hiện virus ở đường hô hấp trên như RSV, virus cúm A và B, virus á cúm type 1, 2, 3, 4a và 4b, virus quai bị, virus sởi. Ngoài ra nó còn có thể được dùng để phát hiện virus Herpes Simplex từ bọng nước... Thành công của kỹ thuật phụ thuộc vào chất lượng mẫu, kỹ thuật chuẩn bị tiêu bản.

2.5. Phương pháp miễn dịch pha rắn

Kỹ thuật miễn dịch pha rắn có nhiều đặc tính ưu việt trong chẩn đoán bệnh do virus như rất nhanh - chỉ cần vài phút cho đến một ngày để thực hiện, sử dụng bệnh phẩm lâm sàng trong giai đoạn sớm của bệnh, có thông tin rất sớm để quản lý các ca bệnh cấp... Một số bệnh ở người đã áp dụng rất thành công phương pháp miễn dịch pha rắn trong chẩn đoán như virus viêm gan A và B, virus Rota, tác nhân Norwalk, virus Adeno, HIV...

2.6. Phương pháp kháng thể huỳnh quang

Phương pháp kháng thể huỳnh quang (FA) chủ yếu sử dụng để đánh giá dịch BAL hoặc mô phổi tươi/đông đá, nhưng hiện tại rất ít ứng dụng. Trong kỹ thuật này, mẫu được gắn trực tiếp với những kháng thể huỳnh quang để xem các nucleocapsid.

Quá trình này nhanh và rẻ hơn kỹ thuật IHC để phát hiện virus PRRS nhưng cũng như IHC, nó không thể phát hiện những chủng virus đa dạng về mặt di truyền và không được khuyến cáo trong giai đoạn sau của bệnh. Hơn nữa hiện tượng dương tính giả có thể là vấn đề bởi độ đặc hiệu thấp của kháng thể sơ cấp hoặc việc nhuộm nền cao. Trong cả hai trường hợp, những mẫu dương tính nên tốt nhất được kiểm tra lại bằng kỹ thuật RT-PCR (hoặc phân lập virus).

2.7 Bộ kít xét nghiệm nhanh

Các thanh xét nghiệm nhanh là một hướng phát triển tương đối mới để chẩn đoán virus PRRS, và mặc dù vẫn chưa được sử dụng rộng rãi nhưng chúng có ích trong việc phát hiện virus PRRS nhanh và thuận tiện mà không cần chuyên môn hoặc các trang thiết bị đặc biệt.

Những thanh kiểm tra này giúp phát hiện virus trong huyết thanh hoặc trong dịch mô bởi miễn dịch sắc ký. Các mẫu này được trộn với những kháng thể đơn dòng có gắn vàng, có đích là các protein PRRS đặc trưng, sự kết hợp protein- kháng thể được lưu giữ trên các thanh xét nghiệm. Dạng kết hợp được giữ trên các thanh này được phát hiện thông qua một kháng thể thứ 2 đã gắn vào trước đó.

Trong những nghiên cứu ở Trung Quốc, những thanh xét nghiệm này đã chứng minh có độ nhạy vượt quá 93% và độ đặc hiệu vượt quá 96%, tuy nhiên các dữ liệu hiện tại vẫn chỉ trên một khoảng giới hạn của các virus.

2.8. Kỹ thuật phân tử PCR đa mồi Xtag

Đây là một trong các phương pháp chẩn đoán virus chỉ giúp phát hiện từng loại virus riêng lẻ. Việc đưa vào ứng dụng kỹ thuật mới PCR đa mồi xTAG có thể phát hiện cùng lúc 18 virus gây bệnh hô hấp đã giúp cho quá trình phát hiện và điều trị các bệnh hô hấp đơn giản, thuận tiện và đạt hiệu quả cao.

Đây là phương pháp được đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian trả kết quả được rút ngắn xuống còn 24g. Việc phát hiện sớm căn nguyên virus của bệnh nhiễm khuẩn hô hấp giúp hạn chế sử dụng kháng sinh không cần thiết cho bệnh nhân, nâng cao hiệu quả điều trị và giảm chi phí điều trị.

2.9 Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu thụ động ngược (PHA)

Kết quả tiến hành phương pháp này nếu trong huyết thanh thử có HBsAg thì hiện tượng ngưng kết sẽ xảy ra do hồng cầu cừu sẽ tụ tập lại một cách thụ động.

Phản ứng âm tính khi không có hiện tượng ngưng kết xảy ra, xuất hiện hình nút hoặc hình vòng nhẫn của các hồng cầu không ngưng kết lắng xuống đáy giếng. Phản ứng dương tính khi có hiện tượng ngưng kết xảy ra, không có hình nút hoặc vòng nhẫn.

Phương pháp này không cần dụng cụ đắt tiền, cách tiến hành đơn giản, đọc kết quả bằng mắt thường nên còn được ứng dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh khác. Tuy nhiên, nó ít nhạy so với kỹ thuật ELISA.

2.10 Kỹ thuật miễn dịch sắc ký

Quy trình làm xét nghiệm này đơn giản, nhanh, chỉ trong vài phút, đọc kết quả bằng mắt thường. Cùng với kỹ thuật ngưng kết, kỹ thuật test nhanh được WHO khuyến cáo là có thể dùng sàng lọc máu ở những phòng xét nghiệm quy mô nhỏ, ở nơi xa xôi hẻo lánh hoặc trong những tình huống cấp cứu.

Hiện nay, test nhanh HBsAg được áp dụng để sàng lọc người hiến máu tại địa điểm tổ chức hiến máu tình nguyện, sau đó tiến hành sàng lọc đơn vị máu hiến một lần nữa bằng kỹ thuật ELISA hoặc hóa phát quang tại phòng xét nghiệm.

2.11 Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym (ELISA)

Kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã biết được cố định trên pha rắn, các pha rắn thường dùng nhất là:

• Ở mặt đáy và mặt bên thành các giếng nhựa
• Trên bề mặt các hạt polystyrene hoặc nguyên liệu khác
• Trên bề mặt các dụng cụ đặc biệt, dùng một lần cho các hệ thống tự động.
• Các giải hoặc màng nitrocellulose. Cách này thường dùng trong phương pháp Western.

Enzym cộng hợp cùng với hệ thống hiện màu đóng vai trò là hệ thống phát hiện phức hợp kháng nguyên- kháng thể được tạo thành.

2.12 Kỹ thuật miễn dịch enzym vi hạt (MEIA)

Phương pháp ELISA cải tiến mới đây dùng các vi hạt (microparticles) và phương tiện vi tính cho ra các xét nghiệm miễn dịch enzym vi hạt (MEIA) khá nhanh (45 phút) và hoàn toàn tự động.

Nguyên lý cơ bản của thử nghiệm vi hạt khác với thử nghiệm trên giếng là toàn bộ bề mặt của hạt gelatin hoặc hoặc hạt latex có kích thước khoảng 1mm trong huyền dịch với đệm thích hợp. Mỗi thử nghiệm dùng một thể tích huyền dịch, trong đó bao gồm hàng triệu hạt nhỏ. Các hạt này cung cấp diện tích bề mặt lớn cho phản ứng. Phần lớn thử nghiệm vi hạt được thiết kế cho hệ thống chuyên dụng và chứa trong các giếng nhỏ, trong đó xảy ra phản ứng. Nguyên lý kỹ thuật và phương pháp giống như kỹ thuật ELISA. Hệ máy PRISM và AxSYM của hãng Abbott là các ví dụ về thử nghiệm này.

2.13 Kỹ thuật miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA)

Kỹ thuật này được thực hiện trên máy tự động hoàn toàn.

Dùng kháng thể đã biết để phát hiện kháng nguyên chưa biết, và ngược lại. Dùng hệ thống phát hiện là điện hóa phát quang để nhận biết được sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên- kháng thể.

Kỹ thuật bao gồm các phản ứng:

• Phản ứng miễn dịch: kháng nguyên kết hợp đặc hiệu với kháng thể được đánh dấu bằng ruthenium. Sử dụng sự tương tác của biotin và streptavidin cùng với các vi hạt có từ tính để gắn phức hợp kháng nguyên-kháng thể (đánh dấu bằng ruthenium) vào pha rắn.
• Phản ứng điện hóa phát quang: để phát hiện sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên- kháng thể đánh dấu bằng ruthenium. Dưới tác dụng của điện, phức hợp ruthenium phản ứng với tripropylamine (TPA) và phát quang.

Kết quả phản ứng điện hóa phát quang là tín hiệu ánh sáng được máy ghi nhận và suy ra nồng độ ban đầu của kháng nguyên hoặc kháng thể có trong mẫu thử.

2.14 Chẩn đoán huyết thanh học

• Phương pháp định lượng kháng thể: Có các phương pháp sau để xác định kháng thể kháng virus: (a) Phương pháp xác định trực tiếp sự tác động qua lại giữa kháng nguyên và kháng thể; (b) Phương pháp phụ thuộc vào khả năng của kháng thể tác động qua lại với kháng nguyên, thực hiện với một vài chức năng không liên quan đến virus; (c) Phương pháp xác định trực tiếp khả năng kháng thể cản trở một vài chức năng đặc hiệu của virus.
• Đáp ứng kháng thể đối với nhiễm virus: Trong hầu hết các nhiễm virus tiên phát, kháng thể tăng lên một cách có ý nghĩa trong huyết thanh. Do đó, xác định mức độ kháng thể trong cặp mẫu huyết thanh thu thập ở giai đoạn sớm trong quá trình bệnh (cấp) và muộn hoặc sau khi đã khỏi bệnh (lui bệnh) có thể được sử dụng để chẩn đoán. Tuy nhiên cũng có một số trường hợp ngoại lệ không có đáp ứng kháng thể sau nhiễm virus.
• Định lượng kháng thể IgM và IgA: Kháng thể IgM thường được tạo ra sớm sau nhiễm virus, thường tồn tại khoảng từ 1 đến 3 tháng có khi lâu hơn. Sự phát hiện được IgM trong nhiều trường hợp có nghĩa là có sự nhân lên hoặc hiện diện của virus. Do vậy, định lượng IgM là một công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán virus cho kết quả chẩn đoán sớm trong quá trình nhiễm bệnh, rất hữu ích để quản lý bệnh nhân. Kháng thể IgA cũng được tạo ra sớm, nhưng nó thường tồn tại lâu hơn IgM.