Ưu - nhược điểm của xét nghiệm sinh học phân tử

Xét nghiệm sinh học phân tử phát triển từ sự thành công của kỹ thuật nhận dạng và giải trình tự gen, cho phép xác định nhanh chóng, chính xác nguyên nhân gây bệnh ở mức độ phân tử, từ đó điều trị bệnh hiệu quả hơn. Bên cạnh những ưu điểm thì xét nghiệm sinh học phân tử cũng có những hạn chế nhất định.

1.1. Sinh học phân tử

Sinh học phân tử là ngành khoa học nghiên cứu sinh vật hoặc các hiện tượng sinh vật ở mức độ phân tử, sinh học phân tử có liên quan mật thiết với các môn khoa học sự sống khác như sinh hóa hay di truyền y học.

Bên cạnh việc nghiên cứu hình thái sinh vật ở mức độ phân tử một cách tinh vi, sinh học phân tử còn nghiên cứu sự hình thành và phát triển của tế bào, cơ quan, cá thể, loài (về số lượng, kích thước) cũng như nghiên cứu chức năng của các quá trình đó.

Ngành sinh học phân tử tìm hiểu mối liên hệ giữa các hệ thống khác nhau trong tế bào, mối liên hệ giữa các phân tử acid nucleic (DNA, RNA), quá trình tổng hợp protein. Ngoài ra, sinh học phân tử còn tìm hiểu cơ chế điều hòa những mối liên hệ này. Các kiến thức sinh học phân tử giúp tìm hiểu kỹ hơn luận thuyết trung tâm (Central Dogma) trong ngành di truyền học để có những can thiệp, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y dược, công nghiệp, nông nghiệp,...

1.2. Xét nghiệm sinh học phân tử

Xét nghiệm sinh học phân tử là ứng dụng khoa học sinh học phân tử để phát hiện chỉ thị sinh học ở mức độ phân tử từ các đoạn acid nucleic, gene hoàn chỉnh cho đến bộ gene của vi sinh vật.

Kỹ thuật nhận dạng và giải trình tự gene thành công từ những năm 80 của thế kỷ trước đã tạo ra bước đột phá cho việc tổng hợp chuỗi gene - phản ứng khuếch đại gene (PCR: polymerase chain reaction), đó chính là cơ sở của xét nghiệm sinh học phân tử.

Kỹ thuật xét nghiệm sinh học phân tử trong y học giúp xác định nguyên nhân gây bệnh nhanh chóng, chính xác để phục vụ cho việc chẩn đoán, điều trị và theo dõi bệnh.

2.1. Xét nghiệm sinh học phân tử PCR

Bản chất của kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction là phản ứng khuếch đại gen) tạo nhiều bản sao từ một phân tử DNA với sự có mặt của DNA-polymerase và chu trình nhiệt (thermocycle), giúp nhận diện nhanh chóng vi sinh vật gây bệnh.

Trong cơ thể sinh vật, với nguyên liệu bazơ nitơ (thành phần cấu tạo DNA) và chất xúc tác DNA-polymerase, các phân tử DNA sẽ tự nhân lên. Để quá trình sao chép DNA diễn ra ngoài cơ thể, bên cạnh các bazơ nitơ và DNA-polymerase, cần phải cung cấp thêm các đoạn mồi (primer), dung dịch đệm (buffer) và chu trình nhiệt (thermocycler). Quá trình biến đổi nhiệt độ theo chu kỳ sẽ làm biến tính DNA làm cho 2 mạch DNA phân ly, sự bắt cặp bazơ nitơ diễn ra và kéo dài mạch mới.

Kỹ thuật PCR sử dụng các thermocycler (máy PCR) thông thường, cho phép xác định có vi sinh vật gây bệnh trong mẫu thử hay không (giá trị định tính).

2.2. Xét nghiệm sinh học phân tử Real-time PCR

Kỹ thuật Real-time PCR cùng với kỹ thuật PCR là 2 kỹ thuật chính được sử dụng trong xét nghiệm sinh học phân tử.

Real-time PCR gần tương tự như PCR, tuy nhiên Real-time PCR có thêm thiết bị ghi nhận tín hiệu khi xảy ra phản ứng tổng hợp. Dựa vào việc so sánh số vòng xảy ra trong mẫu thử và số vòng trong mẫu chuẩn với cùng một khoảng thời gian, sẽ tính được tỷ lệ số vòng mẫu thử/ số vòng mẫu chuẩn, từ đó tính được nồng độ DNA mẫu thử.

Nếu PCR khuếch đại gene theo hệ số mũ với khoảng 20 - 35 vòng - chỉ có giá trị định tính thì kỹ thuật Real-time PCR cao hơn PCR khoảng 50 - 60 vòng, cho phép tính được lượng vi sinh vật trong mẫu thử, do đó Real-time PCR có ưu điểm hơn PCR ở giá trị định lượng.

2.3. Điện di trên gel

Điện di trên gel là kỹ thuật tách các đoạn DNA, RNA hay protein dựa trên sự khác nhau về điện tích và khối lượng của chúng.

Nguyên lý của điện di là mỗi phân tử acid nucleic hay protein mang điện tích nhất định, nên khi đặt chúng trong một điện trường thì chúng sẽ di chuyển. Phân tử có kích thước càng lớn thì di chuyển càng chậm và ngược lại. Điện di có thể được tiến hành trên gel (thường là agarose) hoặc có thể điện di trên giấy.

Việc nhận biết vị trí của các phân tử trên gel hoặc trên giấy nhờ vào các chất nhuộm thích hợp. Điện di cho phép so sánh kích thước của acid nucleic được tách trên gel với kích thước đã biết trước của các phân tử trong mẫu chuẩn.

2.4. Southern blotting

Kỹ thuật này cho phép xác định và phân lập đoạn DNA mong muốn thông qua kết quả “lai” của các mẫu nucleic acid được đánh dấu và các nitrocellulose filter.

2.5. Northern blotting

Phép “lai” trong kỹ thuật Northern blotting tương tự như phép “lai” trong Southern Blotting, tuy nhiên thay vì lai các đoạn DNA đã tách trên gel thì Northern blotting cho phép lai các đoạn RNA được tách trên gel để xác định RNA mong muốn.

2.6. Western blotting

Các protein được tách trên gel sẽ được xác định bằng các kháng thể biết trước thông qua kỹ thuật Western blotting.

2.7. Immunohistochemistry

Immunohistochemistry (hóa miễn dịch tổ chức) với sự có mặt của kháng thể cho phép xác định protein.

2.8. Microarray

DNA microarray (genechip) vẫn dựa trên nguyên tắc “lai” DNA-DNA hay DNA-RNA qua các liên kết hóa học, kỹ thuật Microarray có cả ý nghĩa định tính và định lượng.

2.9. Giải trình tự gene

Giải trình tự gene đang phát triển và có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Các giá trị của việc giải trình tự gene có thể kể đến là định danh vi khuẩn, virus, định type vi khuẩn, virus hay nhận dạng cá thể, nhận dạng loài, hay có thể xác định đột biến gen. Giải trình tự gene đã được ứng dụng trong sản xuất vaccine hay liệu pháp điều trị trúng đích trong ung thư.

Các phương pháp xét nghiệm cổ điển tỏ ra hạn chế khi xuất hiện nhiều loại vi sinh vật mới gây bệnh, có thể kể đến như virus Covid-19, cúm A/H5N1, cúm A/H1N1, HPV... Sinh học phân tử cho phép chẩn đoán nhanh, chính xác vi sinh vật gây bệnh, để điều trị kịp thời, hiệu quả.

Real-time PCR còn cho phép định lượng được tác nhân gây bệnh, điều này rất quan trọng trong điều trị các bệnh nhiễm virus viêm gan B và C, HIV,...

Một ưu điểm khác của xét nghiệm sinh học phân tử là có thể khảo sát với nhiều loại bệnh phẩm khác nhau như máu, đờm, nước bọt, phân, nước tiểu, dịch màng phổi, dịch màng bụng,...

Sinh học phân tử cũng có ý nghĩa trong việc nghiên cứu cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh lý, trong đó có ung thư thông qua 2 kỹ thuật PCR và Real-time PCR.

Xét nghiệm sinh học phân tử còn được ứng dụng trong việc chẩn đoán trước sinh và sau sinh. Xét nghiệm DNA phôi thai trong máu phụ nữ mang thai có thể phát hiện trước sinh hội chứng Down. Trên thế giới, một số bệnh di truyền khác cũng đã được phát hiện trước sinh nhờ ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử có thể kể đến như: bệnh di truyền Duchenne, bệnh beta-Thalassemia, bệnh xơ nang (cystic fibrosis), Phenylceton niệu... Bên cạnh đó, chẩn đoán sơ sinh ở trẻ mới sinh ra cũng đạt nhiều kết quả tiến bộ nhờ xét nghiệm sinh học phân tử, kỹ thuật này có thể phát hiện các bệnh lý như tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh, thiếu men alpha-1 antitrypsin, bệnh xơ nang...

Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng xét nghiệm sinh học phân tử vẫn có một số hạn chế nhất định. Những điều kiện nghiêm ngặt được đặt ra trong xét nghiệm sinh học phân tử nếu không muốn kết quả sai sót:

• Đối với kỹ thuật PCR: Nếu nồng độ nguyên liệu tổng hợp không hợp lý hoặc quá trình điều nhiệt không đúng từng giai đoạn thì hiệu suất của PCR sẽ rất thấp, thậm chí là không xảy ra, điều này dẫn đến kết quả âm tính “giả”. Hoặc chỉ một chút sơ suất để nhiễm chéo giữa các mẫu thử thì lại kết quả PCR dương tính “giả”.
• Đối với kỹ thuật Real-time PCR: Bên cạnh các điều kiện nghiêm ngặt cần được đảm bảo tương tự như kỹ thuật PCR thì kỹ thuật Real-time PCR đòi hỏi mẫu chuẩn thật tốt để so sánh để cho kết quả định lượng chính xác. Một yêu cầu được đặt ra là phải so sánh 1 mẫu thử với 5 mẫu chuẩn để loại trừ sai sót, do đó kỹ thuật đòi hỏi tính kiên nhẫn cao.

Ngoài ra, xét nghiệm sinh học phân tử còn có một số hạn chế khác:

• Chỉ định lượng được mẫu thử trong một phạm vi nồng độ giới hạn, nếu ngoài khoảng đó thì sẽ không chính xác.
• Chỉ mới có bản giải trình tự gen của một số ít loại vi sinh vật trong khi số lượng loại vi sinh vật thì rất nhiều, do đó không phải bệnh nào cũng có thể chẩn đoán bằng xét nghiệm sinh học phân tử.

Tóm lại, xét nghiệm sinh học phân tử đã và đang khẳng định vai trò của mình trong sự phát triển của y học hiện đại với tính ứng dụng ngày càng cao. Tuy nhiên, xét nghiệm sinh học phân tử vẫn còn những hạn chế và sai sót nếu không đảm bảo quy trình xét nghiệm nghiêm ngặt.